Quick Cell 外泌體提取試劑盒使用說明書

Quick Cell 外泌體提取試劑盒

產品描述
   外泌體是由細胞分泌的包含RNA和蛋白質的小囊泡（20-200 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等體液中大量存在。外泌體被認為具有細胞間信使的功能，在特定細胞之間傳遞它們的效應物或信號分子；然而其構造、效應物組成以及所參與的生物學通路目前尚不明晰。
 外泌體的生物學功能研究中需要分離完整的外泌體顆粒，而傳統超速離心方法步驟繁瑣、硬件要求高、操作難度大。李記生物自主開發的外泌體快速提取試劑盒，組分經過優化處理，適用于細胞培養上清液、血清、血漿、尿液及其他體液（腦脊液、腹水、羊水、乳汁以及唾液等）中的外泌體提取，并搭配純化過濾裝置，可快速地獲得高純度外泌體顆粒。
本試劑盒處理單位樣品成本僅為國外同類產品的1/6-1/3，經上海市計量測試技術研究院檢測，本試劑盒與國外產品提取純化相同樣品所得的外泌體，沒有顯著差異。
試劑盒組成

       *RNase/DNase Free, Sterile

運輸與保存條件

常溫運輸，室溫條件下質保期24個月，使用前充分混勻。

使用方法

1.條件準備 

①高速離心機(可達10000g離心力)；2mL、50mL(或15mL)離心轉子；1.5mL，50mL(或15mL)離心管；② 1×PBS緩沖液。

2.樣品預處理

①樣品準備：如果是凍存樣品，從冰箱取出后于25℃水浴中進行解凍，將*融化后的樣品置于冰上；如果是新鮮樣品，收集樣品后置于冰上；

②離心去除細胞碎片，將樣品轉移至離心管中，在4℃，3000 g條件下離心10 min，取上清轉移到新離心管中。

③離心去除其他雜質，*次離心收集的上清液，在4℃，10000 g條件下離心20 min，取離心上清液轉移到新的離心管中備用。

注：本試劑盒盒可處理多種樣品，處理量因樣品種類不同而有差異。單次提取可處理的不同樣品量范圍見下表。

表1.單次提取可以處理的不同樣品量的范圍（單位：mL)

3.提取外泌體

①上清液預處理：在去除雜質的離心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS試劑）；部分粘稠的樣品（血清、血漿、乳液、唾液等）需先加入預冷的與樣品等體積的1×PBS進行稀釋，之后再加入ECS試劑，試劑用量如下表，表中樣品為舉例值，其他劑量樣品根據表中的試劑用量等比例調整。

表2.外泌體提取試劑用量表（單位：mL）

②溶液混合：加入ECS試劑后將離心管蓋緊，上下顛倒離心管10-20次，再放置于2℃至8℃靜置過夜（10 h-12 h）；

③沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管于4℃以10000 g離心60 min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；（注：盡可能吸凈上清液）

④外泌體重懸：取400μL 1×PBS均勻吹打離心沉淀物，待其均勻懸浮在PBS中后，將重懸液轉移至新的1.5 mL離心管中；

⑤收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的1.5mL離心管于4℃以12000 g離心2 min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒。

4.純化外泌體

①純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉入Exosomoe Purification Filter（EPF柱）上室中，于4℃以3000 g離心10 min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒；

②外泌體的保存：純化后的外泌體以50 -100μL進行分裝，分裝后的外泌體保存于-80℃低溫冰箱中，以備后繼實驗使用。

常見問題

Q1：粘度大的待測樣本如何處理？

A1：待測樣品粘度過大時，可將樣本用4℃預冷的1×PBS緩沖液進行等體積稀釋處理。

Q2：收獲的外泌體顆粒無法通過EPF柱純化時怎么處理？

A2：由血清、血漿、唾液等樣品收獲的外泌體濃度較高，此時可用4℃預冷的     1×PBS進行稀釋后再通過EPF柱離心。

Q3: 外泌體如何保存？

A3：純化完成后的外泌體可50 μL-100 μL分裝后保存于-80℃備用。

Q4：如何鑒定提取的外泌體？

A4：針對外泌體標志蛋白（CD63, CD9, CD81等）進行Western blot檢測鑒定所提的外泌體Q5：培養細胞時，血清來源的外泌體怎么去除？

A5：多數情況下，細胞在體外培養需要血清，但血清中含有外泌體，為了避免血清污染細胞產生的外泌體，一般采用2種方法：

①細胞培養前，通過100000×g超速離心過夜，去除血清外泌體。

②可選擇無血清培養基進行培養。

Q6：細胞培養過程中死細胞是否會影響外泌體的提??？

A6：會的。在收獲細胞時，應確定死亡細胞占所有細胞5%以下。細胞死亡過程中會釋放大量大小不等的囊泡，細胞zui終會裂成碎片，它們在外泌體的純化過程中會污染活細胞產生的外泌體。

應用案例

1、外泌體電鏡檢測：

    本試劑盒提取純化的PC-12細胞培養上清液中的外泌體顆粒，通過透射電鏡（TEM）檢測的結果：

從電鏡照片中可觀察到100 nm左右、具有清晰的膜的茶托樣結構，符合外泌體的結構特性（scale bar=100 nm）。

2、外泌體粒徑檢測：

    本試劑盒提取純化的PC-12細胞培養上清液中的外泌體顆粒，通過美國PPS公司（Particle Sizing Systems） Nicomp 380 Z3000粒度儀檢測的結果：

從粒徑檢測結果來看，納米顆粒主要分布在10-100nM之間，和預期的外泌體顆粒大小基本吻合（橫坐標單位為 nM）。

3、Western blot及qPCR檢測：

上圖為本試劑盒提取的MCF-7及MHCC97H細胞培養上清液中外泌體膜蛋白CD63的western blot（A）和miRNA qPCR（B）檢測結果。